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理科

線虫 C.elegans の教材化

法政大学女子高等学校 鈴木 恵子

はじめに

2003年に「ゲノムひろば」ではじめて線虫に出会い,これまで線虫を使った実験に取り組んできた。これまで高校の教科書には記載されることがなかったが,ようやく新教育課程の教科書に登場した。線虫はいろいろな実験に使える優れた教材生物である。ぜひ,広く知っていただきたいと考え,ご報告させていただく。

Ⅰ 線虫 C.elegansとは

線虫(線形動物)とは,線形動物門(nematoda)に属する動物の総称で,1mm以下から数十cmのものまで,推定で50万種以上(最大見積り1億種)といわれている。多くは非寄生性で,海洋,淡水,土壌中に生息し,一部が動物や植物に寄生すると言われている。寄生性のものには,回虫や蟯虫,アニサキス,マツザイセンチュウ,ネコブセンチュウなどがいる。

C.elegans (Caenorhabditis elegans)は,イギリスの細菌を主食とする体長約1mmの非寄生性(自由生活性)の線虫(nematode)の一種で,ショウジョウバエと並ぶ遺伝学の代表的なモデル生物で,2002年ノーベル生理学・医学賞を3人のC.elegansの研究者が受賞したことは有名である。その特徴は,体長1ミリ程度で動物に必要な最小限の体制をすべてそろえており,細胞数は雌雄同体で959個,雄で1031個で,受精から成虫に至るまでの細胞系譜が完全に解明されている。また,約1000個の体細胞のうち302個が神経細胞である。

遺伝子数は約19000個,ゲノムサイズは約100Mbpと非常に小さく,多細胞生物で最初にゲノムの全塩基配列が決定され,ヒトの遺伝病原因遺伝子や癌遺伝子等と共通の遺伝子をもち,個体レベルでの機能や作用機構を調べるモデル生物として注目されている。

多くの線虫は雌雄異体であるが,C.elegansは雌雄同体で,成虫は約300個の受精卵を生み,ライフサイクルは約3日(20~25℃)と短く,卵は約半日で孵化,幼虫は2日半で4回脱皮して,1齢~4齢幼虫を経て成虫になる。

過密・餌不足になるとフェロモンを出し,2齢幼虫は脱皮後に身の細い耐性幼虫になり,乾燥や高温にも耐性を示し,60日から長いものは6ヶ月も苛酷な環境下を生きながらえる。線虫は,飼育温度が25℃を越さなければ室温飼育が可能で,系統維持が比較的容易である等の利点を持ち,いろいろな実験に使えるので,教材生物として有用である。ここでは,代表的な実験例を紹介する。

Ⅱ 線虫の培養方法

線虫を培養・維持するためには,餌にする大腸菌を育て,線虫用の倍地に塗布する必要がある。長く維持するためには,すべて無菌的に行う。

1.餌の大腸菌の培養(あるいは,納豆菌でも代用可)

えさの大腸菌には,OP50株が一般的に使われている。コロニーをとり37℃で一晩培養し白っぽくなったLB液体培地を,線虫の培養プレートに滴下して薄く塗り広げ,さらに1日程度置く。

納豆菌でも餌として有効なことが確認できている。ブドウ糖を添加した豆乳または牛乳培地50mLに納豆粒を1粒入れて,OP50と同様にする。

豆乳(牛乳)培地(200mL)

豆乳(牛乳) 20 mL
グルコース
蒸留水 180 mL

2.M9バッファーの作成方法

M9バッファーは,線虫を培地から洗い取ったり,線虫を洗ったりするときに使うバッファー。三角フラスコに,下記の薬品と蒸留水を加えて500mlにし,20分間オートクレーブにかけて,M9バッファーを作成する。

M9 buffer

KH2PO4 3g
Na2HPO4 6g (12水和物 15.13g)
NaCl 5g
1000mlにメスアップ,オートクレーブ,60℃に冷却後
1M MgSO4(滅菌済み) 1ml

3.線虫培養用寒天培地(簡易版)の作成方法

一般的には,線虫を培養する寒天培地はNGM(Nematode Growth Medium)寒天培地が使われる。このNGM寒天培地のプレートに,前述の餌の大腸菌を塗布し,線虫を培養する。しかし,NGM寒天培地の作成は手間がかかるので,ここでは,前述のM9バッファーを使って作成した培地を紹介する。作成方法は,2%になるように寒天を加えて,20分間オートクレーブにかけて,無菌処理済みのシャーレに無菌的に流し入れ,寒天プレートを作成する。正式な培地のNGM培地ではコレステロールを添加するので,コレステロールが入手できるなら,5mg/Lになるようにエチルアルコールに溶かし添加するとよいかもしれない。

4.線虫培養プレートへの大腸菌塗布と線虫の移植

① 無菌的に餌の大腸菌の培養液(あるいは納豆菌液)を6cmプレートで30μLを目安に滴下し,滅菌したガラス棒の先などで薄く塗り広げる。

② 常温で一晩置き,大腸菌(納豆菌)を増やす。このまま,冷蔵庫で1か月程度保存できる。

③ 線虫を,滅菌したミクロスパーテル,滅菌したつまようじなどで寒天片ごと切り出し,新しいプレートに移す。植え継ぎは,大腸菌の場合1~2ヶ月に1回程度行う。納豆菌の場合は期間は長めで可能。先端を平たくつぶした白金線をパスツールピペットの先端にとりつけたピックという小道具を作成して,実体顕微鏡で見ながら線虫を1匹ずつ釣り上げて,数匹移してもよい。

Ⅲ 胚の観察

一般的には,実体顕微鏡下で成虫個体の腹を切って体外に出てきた胚を観察する。しかし,慣れない生徒が限られた時間内で観察することは難しいので,手軽に観察できる方法を工夫してみた。

① 線虫が大量に増殖したプレートを用意し,プレートに水を適宜ふりかけ,表面をピペッティングで洗うようにして線虫を集め試験管に移す。

② しばらく静置するか,手動の遠心機で軽く遠心すると線虫が沈むので,沈殿部をピペットでとり別のシャーレに移す。3000回転で15秒~30秒程度遠心をすれば,上澄み中の卵(胚)も回収できる。このままでプレパラートを作成しても,成虫の腹の中の胚を経時的に観察できる。

③ 線虫の腹の内部の胚を体外に出すために,かみそり10枚位の間にビニールテープなどを挟んで重ねたものでシャーレ中の線虫を無差別に細かく切り刻む。このサンプルをホールスライドグラスに滴下し観察する。いろいろな成長段階の胚や線虫を同時に観察できる。

ある時,餌がなくなった環境下で,大変興味深い現象が観察された。親の線虫の体の中で,子の線虫がうごめいている現象である。餌が乏しくなると,産みだされても子の生存が危ういので,体内で孵化させて,少しでも親の体を餌に生き延びさせようという涙ぐましい生存戦略であり,飢餓におかれた線虫に比較的頻繁に起こる現象のようだ。



Ⅳ 卵核と精核の融合と卵割の観察

スライドグラスにM9バッファーを滴下し,そこに成虫の線虫を数匹入れて,実体顕微鏡下でメスまたは注射針を使って成虫個体の腹を切って体外に出てきた卵や胚をじっくり観察する。卵核と精核の融合や卵割が経過する様子を比較的簡単に観察できる。特別な染色も必要ない。道具としては注射針が意外に鋭く切りやすく,成虫の腹を切るコツは,極力水分を少量にして切ると,刃物と水との表面張力による線虫の動きを抑えることができ切りやすくなる。観察を長く続ける場合は,egg salt(118mM NaCl 48mM KCl)を使う。

Ⅴ 線虫(C.elegans)の変異体の観察

線虫には,特徴的な観察しやすい変異体がいくつかある。線虫の代表的な変異体を観察することは,突然変異の具体例を知るよい教材になる。ダンピー(dpy)はずんぐりとして短い変異,ブリ(bli)は体表に水ぶくれが生じる変異で,いずれもコラーゲンの異常が原因の変異体である。ロング(lon)はその名のとおり体長が長く,アンク(unc)は神経の働きの異常が原因で,前進できずコイルを巻くような動きになり,ロル(rol)はひきつったような動きをする。

当校では,野生型(N2)とともに,班に1枚づつ変異体を培養したプレートを,名前を伏せて与え,変異体の特徴を手掛かりに変異体名を当てさせる形で観察させている。生徒はクイズ感覚で熱心に観察する。

Ⅵ 線虫(C.elegans)の化学走性行動の観察

線虫は,食塩やアミノ酸に対して正の走化性を示す。一方,食塩の存在下で飢餓を経験すると負の走性(忌避行動)を示す。感覚変異体を使い,野生型と比較するとさらに面白い走性実験ができる。

方法

① 対照(A)と食塩または試験物質(B)の濃度勾配を作ったアッセイプレートを作成する。アッセイプレートは,M9バッファー,2%寒天で作成する。揮発性物質の場合は,ふたに試験物質をセットして濃度勾配をつくる。

② 線虫を増やした培養プレートから線虫を回収し,M9バッファーで軽く洗浄し,遠心にかけて線虫を中央に置く。余分な水分は,キムワイプを割いて紙縒りにしたもので,できるだけ除く。

③ 30分間静置し,線虫の集まり具合を観察する。個体数をカウントして,化学走性指数を計算する。線虫の動きを止めるには,氷上またはクロロフォルムで麻酔をかける。肉眼で見てマジックペンで点をつけながらカウントするか,実体顕微鏡の画像を写真や動画に撮影して後にカウントするとする方法も有効である。

化学走性指数=

Ⅶ 線虫の配偶行動の観察と交配実験

染色体構成は6本で,Ⅰ~Ⅴの常染色体とXの性染色体があり,メスではXX,オスではXOである。オスとメスでは,尾部の交接器に違いがあり,体もオスがやや小さく区別できる。面白いことに,オスは染色体の不分離の結果生じ,通常約500~700個体に1個体程度の出現率であるが,人為的にオスを作成できるので,オスを作って配偶行動を観察したり,交配実験をしたりすることができる。交配実験用には交配率を高めるため小さめの3センチプレートを使い,餌を塗る面積も少なくする。

オスの作り方

① 6センチプレートに野生型のL4の幼虫(陰門付近に白い三日月状の卵巣が目印)を7~10匹いれて,30℃で6時間の熱ショックの後,20℃で培養する。

② 子世代に約1%の割合でオスが生まれるので,交配用の3センチプレートにオス7~10匹に,メスのL4の幼虫3~4匹を入れて交配させる。交配がうまくいっていると,理論どおりオスが約1/2の比率で得られる。これをオスプレートとし,変異体との交配実験に使う。

オスの配偶行動

交配実験の方法

① 交配用の3センチプレートに,野生型のオス7~10匹とdpyかuncなどの劣性変異体のメスのL4の幼虫3~4匹を入れて交配させる。

② 交配が成立していると生まれたF1は野生型になるので,野生型のF1を適当数,1匹ずつ別の新しいプレートに移す。

③ F1から生まれたF2の各表現型の個体数をカウントし,F2の表現型の分離比を求める。

Ⅷ 線虫の遺伝子解析

メンデル遺伝の実習時に得られたF2には,3つの遺伝子型の個体がある。変異体にuncを使った場合,これらの遺伝子解析で遺伝子型を判定することができる。ただし,uncの遺伝子座には100を超える遺伝子座が知られており,ここに紹介する方法は,変異株unc-32の場合である。

プライマーの配列

Forward 5'- CTTCCCACATCTTTCTCTCTCCTTAAATCCTCC -3'
Reverse 5'- AGCAGGTGGCAACATTTCTCCAGTCCAGGC-3'

PCR産物

125 bp(ベースペア=塩基数)

PCR チューブに入れる試薬類

ddH2O 7μL
10×EX Taq Buffer 1μL
dNTP Mixture 1μL
EX Taq 0.05μL
プライマー(F+R) 2μL
鋳型DNA 2μL

Total 11μL

PCR 条件

熱変性 95℃ 4分
熱変性 95℃ 40秒 35サイクル
アニーリング 58℃ 40秒
伸長反応 72℃ 40秒
伸長反応 72℃ 3分

制限酵素 StuⅠ:10units/μℓ

切断配列
AGG CCT
TCC GGA
制限酵素Mix組成
ddH2O 3.3μℓ Mix液
10×M Buffer 1.5μℓ
制限酵素 0.25μℓ

処理の結果

Wt(野生型)  96bp + 29 bp (制限酵素で切断)
Mutant(変異型) 125 bp (制限酵素で切断されない)

おわりに

教材生物を維持することはとても大変であるが,ここで紹介したM9バッファーの培地とすぐ手に入る納豆菌を餌とする方法は,比較的容易に取り組める。線虫は郵送で提供することが可能なので,ご希望の方は,鈴木(YFA15562@nifty.com)まで。

参考サイト